(上海海洋大學食品學院，上海 201306)
茶葉是我國豐富的天然植物資源，富含具有保健藥效功能的茶多酚(Tea Polyphenols，TP)。現(xiàn)代科學研究表明茶多酚是一類新型的天然、高效、安全的食品抗氧保鮮劑。茶多酚易溶于水、甲醇、乙醇、丙醇及乙酸乙酯，不溶于氯仿、苯等有機溶劑，具有增強機體抵抗力、抗氧化、防癌、抗腫瘤、抗輻射、抑菌、抗病毒、降血糖和血脂、預防心血管疾病、抗衰老等多種天然生物活性。目前茶葉中茶多酚的提取多采用溶劑提取法、金屬離子沉淀法、超聲波浸提法、樹脂吸附法等。超臨界萃取法工藝過程簡單，產(chǎn)品純度高，所采用的溶劑為二氧化碳，無毒無污染。
本文探討了以超臨界二氧化碳萃取技術提取綠茶中茶多酚，優(yōu)化了提取條件。本研究旨在開發(fā)一種新的保鮮方法，即通過對比和分析不同濃度茶多酚和特丁基對苯二酚(TBHQ)溶液浸泡過蝦后的pH值變化，及揮發(fā)性鹽基氮值的變化，對茶多酚在南美白對蝦的保鮮效果進行分析研究。
1 材料與方法
1．1 主要儀器與試劑
紫外可見分光光度計；高效液相色譜儀；Delta 320-s型pH計(梅特勒一托利多儀器(上海)有限公司)；KJELTEC(TM)2300凱氏定氮儀(瑞典福斯公司)；超臨界二氧化碳萃取儀(美國Foss公司)。
99%特丁基對苯二酚(TBHQ)；氧化鎂；八種兒茶素和咖啡堿標樣；乙醇，乙酸乙酯，無水硫酸鈉。試劑均為分析純，實驗用水為蒸餾水。
綠茶下腳料。試驗所用南美白對蝦購于上海曹安水產(chǎn)批發(fā)市場。
1．2 超臨界二氧化碳萃取茶多酚流程
干茶葉—一稱取14 g—一放入萃取釜——加熱至所需溫度——打開進氣閥——啟動高壓泵——調節(jié)壓力至所需值——靜態(tài)萃取——動態(tài)萃取同時收集萃取物——取下收集瓶——旋松高壓泵——關閉氣體閥門——開放氣閥——取下萃取釜——關閉機器。
1．3 茶多酚總量的測定及兒茶素類的分析
按GB/T8313—2002測定茶多酚總量；茶多酚制品中兒茶素類含量用高效液相色譜法進行分析。
1．4 揮發(fā)性鹽基氮的測定
揮發(fā)性鹽基氮值用凱氏定氮儀測定。按GB2741—94規(guī)定，海蝦的TVBN(mgN/100g)≤25為一級鮮度；≤30為二級鮮度。稱取2 g左右樣品，剪碎，放人蒸餾管中，加入0.5g氧化鎂固體，迅速放進自動定氮儀蒸餾器上，關上安全門，儀器自動蒸餾、吸收、滴定、計算。同時添加同樣氧化鎂做空白試驗。
1．5 pH值的測定
稱取混勻試樣5g，在燒杯中加入50mL蒸餾水，攪拌均勻，放置30 min(不斷振搖)，然后過濾。濾液用酸度計測定，直接讀取pH值。
2 結果與分析
2．1 超臨界二氧化碳萃取茶多酚條件優(yōu)化
2．1．1 壓力對萃取率的影響 萃取的壓力是超臨界二氧化碳萃取過程中最重要的參數(shù)。萃取溫度一定時，壓力增大，液體的密度增大，在臨界壓力附近，壓力的微小變化會引起密度的急劇改變，而密度的增加將引起溶解度的提高。茶多酚為強極性物質，但是由于本試驗有乙醇作夾帶劑。故在25～40 MPa壓力范圍考察壓力對萃取率的影響，經(jīng)實驗選定萃取壓力為35 MPa。
2．1．2 溫度對萃取率的影響 一方面，溫度升高，超臨界流體密度降低，其溶解能力相應下降；另一方面，溫度升高使被萃取溶質的揮發(fā)性增加，這樣就增加了被萃取物在超臨界氣相中的濃度。當然萃取溫度對溶解度的影響還與壓力有密切的關系：在壓力相對較低時，溫度升高溶解度降低；而在壓力相對較高時，溫度升高二氧化碳的溶解能力提高。最后選擇50℃為萃取最佳溫度。
2．1．3 時間對萃取率的影響 茶多酚的萃取率隨著靜態(tài)萃取時間的增加而增加，時間越長，產(chǎn)物的量越大。但是到達60min以后，茶多酚的萃取率反而隨著時間而下降，提取的效率就降低，能量和二氧化碳的消耗增加，最適宜的靜態(tài)萃取時間應小于60min。
2．1．4 其它條件對萃取率的影響 實驗顯示，純乙醇作為夾帶劑直接萃取茶多酚的效果并不比乙醇水溶液好，這與采用純乙醇直接萃取茶多酚的效果不如乙醇水溶液是一致的。同樣可以看出，65% 的乙醇水溶液作為夾帶劑萃取茶多酚的效果為最佳。另外本試驗中采用動態(tài)萃取過程中動態(tài)在線加入夾帶劑，對茶多酚的萃取率也有很大程度的提高。夾帶劑的用量影響萃取率。隨著夾帶劑量的提高，到一定程度時，茶多酚的萃取率反而下降。由試驗得知，夾帶劑的量(體積mL)：茶葉量(g)為40％時為最佳條件。
實驗還表明，接收劑的不同對茶多酚的萃取率也有影響。65%乙醇溫水浴和乙酸乙脂接收都沒有直接用65%乙醇接收萃取率高，可能是因為溫水浴一定程度上導致了茶多酚的氧化，而乙酸乙脂由于其易揮發(fā)的特性，可能會帶走一部分的茶多酚。試驗表明采用65％乙醇接收茶多酚的效果最好。
出口溫度對萃取率的影響很小，因此，試驗中考慮到二氧化碳在不結冰的情況下，選擇出口溫度為85℃。
2．2 條件優(yōu)化的正交設計
為了提高萃取率，設計了以萃取溫度、壓力、時間、夾帶劑濃度、夾帶劑用量做五因素四水平正交實驗，因素、水平設計見表1。
由正交實驗結果(表2)可知，各因素對萃取率影響的顯著性大小為：A萃取溫度>B壓力>E夾帶劑用量>D夾帶劑濃度>C萃取時間；最佳工藝條件為：A3B2C1Dl，即萃取溫度為50℃，壓力為35MPa，夾帶劑乙醇濃度為65％，萃取時間為60min，夾帶劑的量為40％。根據(jù)該分析結果做了三組驗證實驗，結果顯示茶多酚的平均得率為10.5% ，產(chǎn)品兒茶素含量可達77.35%，高于正交實驗的提取率，說明正交實驗的結果可信。
2．3 茶多酚制品純化
對超臨界萃取出的茶湯進行簡單的減壓蒸餾，去除其中的乙醇，然后進行冷凍干燥，得到茶多酚制品。樣品HPLC分析結果見圖1。八種兒茶素和咖啡堿標樣見圖2。
從圖1中可以發(fā)現(xiàn)，超臨界萃取茶多酚制品中兒茶素(C)的含量為77.35%。研究表明，茶多酚的生物活性，如抗氧化、抗輻射和抗腫瘤等，主要是由兒茶素在起作用，因此除了關注茶多酚總量外，更應注重兒茶素單體的含量。
2．4 茶多酚的應用研究
本文還通過對市場購得的鮮活的南美白對蝦，首先去頭、剝殼，然后分別置于配制好的不同濃度的茶多酚和特丁基對苯二酚溶液中，浸泡半小時。取出，瀝干，裝在保鮮袋里，保存于0～5℃環(huán)境中。定期測定其揮發(fā)性鹽基氮值和pH值，作為鮮度指標。通過對比和分析結果表明：0.4%的特丁基對苯二酚對蝦肉的保鮮效果最佳，在此環(huán)境下可儲存長達10 d的時間；1.6%的茶多酚對蝦肉保存時間可達8 d。但由于茶多酚為天然抗氧化劑，所以相比較茶多酚是比較理想的保鮮劑。
為考察茶多酚的保鮮效果，同時試驗了不同濃度TBHQ溶液對南美白對蝦的保鮮效果，作為對比。在貯藏過程中，對照組A在第7 d其TVBN值已經(jīng)達到了35.64 mgN/100g，超過了二級鮮度的上限，B組和C組到第8 d達到25.67mgN/100g和20.47 mgN/100g，還不到二級鮮度上限。而D組到第9 dTVBN值為22.6 mgN/100g，還不到一級鮮度上限。E組第10 d為25.12 mgN/100g，尚在二級鮮度范圍內。實驗顯示各組pH值升高幅度始終小于對照A組，其中B組和C組的作用最為明顯。
3 結論
3．1 通過單因素條件的選擇以及正交試驗的優(yōu)化，采用超臨界二氧化碳萃取技術提取綠茶中茶多酚的最優(yōu)條件為壓力35 MPa、釜溫50℃、靜態(tài)萃取時間1 h、動態(tài)萃取時間1 h。茶多酚的萃取率為10.5%。
3．2 超臨界萃取出的茶多酚只需簡單的真空冷凍干燥即可得到中兒茶素的含量可達77.35% 的茶多酚制品，而且未檢測出咖啡因。該方法操作簡便，簡單易行，分離效果好，使用成本低，且不需要用到有機溶劑，符合二十一世紀綠色化學的理念。
3．3 在選擇夾帶劑的濃度時，發(fā)現(xiàn)65%的乙醇效果最好，茶多酚的萃取率得到了很大程度的提高。
3．4 超臨界二氧化碳萃取茶多酚，只需進行簡單的后續(xù)處理就可以得到純度較高的茶多酚粉末，進行有效的應用。
3．5 萃取率的大小不僅取決于與溶解度有關的溫度、壓力和夾帶劑等熱力學因素，還取決于與萃取速率有關的分子擴散，流動形態(tài)和夾帶劑等動力學因素。本試驗研究是在試驗室條件下進行萃取條件的優(yōu)化，在實際生產(chǎn)中可能還將受到物料量、反應釜的容積等因素影響。
3．6 茶多酚保存條件下，通過揮發(fā)性鹽基氮值和pH值的綜合分析，發(fā)現(xiàn)1.60％的茶多酚對蝦肉保存時間可達8 d。起到了延長南美白對蝦保鮮期的效果。此外，茶多酚為天然抗氧化劑，對人體不僅無毒，還有一定的保健功能。